این راهنمای خالص سازی DNA به اطلاعات کلی در مورد اصول استخراج dna، آماده سازی پلاسمید و کمیت DNA و همچنین نحوه بهینه سازی تکنیک‌های خالص سازی می‌تواند به افزایش بهره وری شما کمک کند؛ بنابراین زمان کمتری را برای خالص سازی DNA و زمان بیشتری را برای توسعه آزمایش‌ها و تجزیه و تحلیل داده‌ها اختصاص می‌دهید. با ما در ادامه استخراج dna همراه باشید.
مراحل استخراج dna از سلول بافت
پنج مرحله اساسی استخراج DNA و سیتوژنتیک وجود دارد که در تمام شیمی‌های ممکن برای تصفیه DNA سازگار است: ۱) اختلال در ساختار سلولی برای ایجاد lysate و ۲) جداسازی DNA محلول از بقایای سلولی و سایر مواد نامحلول، ۳) اتصال به DNA مورد علاقه ماتریکس تصفیه، ۴) شستشوی پروتئین‌ها و سایر آلاینده‌ها از ماتریکس و ۵) شستشوی DNA.
ایجاد Lysate
اولین مرحله در هر واکنش خالص سازی اسید نوکلئیک، رهاسازی DNA/RNA در محلول است. هدف از لیز این است که به سرعت و به طور کامل سلول‌های یک نمونه را مختل کند تا اسید نوکلئیک را در لیز آزاد کند. چهار روش کلی برای لیز کردن مواد وجود دارد: روش‌های فیزیکی، روش‌های آنزیمی، روش‌های شیمیایی و ترکیبی از این سه.
روش های فیزیکی
روش‌های فیزیکی معمولاً شامل نوعی آسیاب یا خرد کردن نمونه برای برهم زدن دیواره سلولی یا بافت سخت است. یک روش متداول اختلال فیزیکی، انجماد و آسیاب کردن نمونه‌ها با هاون در زیر نیتروژن مایع است تا یک ماده پودری تهیه شود که سپس در معرض شرایط لیز شیمیایی یا آنزیمی قرار می‌گیرد. آسیاب‌ها می‌توانند دستگاه‌های دستی ساده یا خودکار باشند. روش‌های فیزیکی اغلب با مواد ورودی ساختار یافته‌تر مانند بافت‌ها یا گیاهان استفاده می‌شوند. دستگاه‌های دیگر از ضرب یا تکان دادن مهره‌ها در حضور دانه‌های فلزی یا سرامیکی برای از هم گسیختگی سلول‌ها یا بافت‌ها، یا فراصوت برای از هم گسیختگی بافت‌ها و لیز سلول‌ها استفاده می‌کنند.
روش های شیمیایی
روش‌های شیمیایی را می‌توان به تنهایی با موادی که به آسانی لیز می‌شوند، مانند سلول‌های کشت بافت یا در ترکیب با روش‌های دیگر استفاده کرد. از هم گسیختگی سلولی با عوامل مختلفی که غشاهای سلولی را مختل می‌کنند و پروتئین‌ها را دناتوره می‌کنند، انجام می‌شود. مواد شیمیایی که معمولاً مورد استفاده قرار می‌گیرند شامل مواد شوینده (مانند SDS) و چائوتروپ‌ها (مانند نمک‌های گوانیدین و محلول‌های قلیایی) هستند.
روش های آنزیمی
روش‌های آنزیمی اغلب با مواد اولیه ساختار یافته‌تر در ترکیب با روش‌های دیگر با بافت‌ها، مواد گیاهی، باکتری‌ها و مخمر استفاده می‌شود. آنزیم‌های مورد استفاده به از بین بردن بافت‌ها و دیواره‌های سلولی سخت کمک می‌کنند. بسته به ماده اولیه، درمان‌های آنزیمی معمولی می‌تواند شامل: لیزوزیم، زیمولاز و لیتیکاز، پروتئیناز K، کلاژناز و لیپاز و غیره باشد. درمان‌های آنزیمی می‌توانند برای پردازش با توان بالا قابل قبول باشند، اما ممکن است در مقایسه با سایر روش‌های اختلال، هزینه هر نمونه بالاتری داشته باشند.
در بسیاری از پروتکل‌ها، ترکیبی از اختلالات شیمیایی و دیگری اغلب استفاده می‌شود؛ زیرا اختلال شیمیایی سلول‌ها به سرعت پروتئین‌ها، از جمله نوکلئازها را غیرفعال می‌کند.
پاکسازی Lysate
بسته به ماده اولیه، لیزهای سلولی ممکن است نیاز به حذف بقایای سلولی قبل از خالص‌سازی اسید نوکلئیک داشته باشند تا انتقال مواد ناخواسته (پروتئین‌ها، لیپیدها و ساکاریدها از ساختارهای سلولی) به واکنش خالص‌سازی کاهش یابد که می‌تواند غشاها را مسدود کند یا در پایین‌دست تداخل ایجاد کند. معمولاً پاکسازی با سانتریفیوژ، فیلتراسیون یا روش‌های مبتنی بر مهره انجام می‌شود.
سانتریفیوژ می‌تواند به زمان عملی بیشتری نیاز داشته باشد، اما می‌تواند مقادیر زیادی زباله را برطرف کند. فیلتر کردن می‌تواند یک روش سریع باشد، اما نمونه‌هایی با مقدار زیادی زباله می‌توانند فیلتر را مسدود کنند. پاکسازی مبتنی بر مهره، مانند روشی که با کیت‌های آماده سازی پلاسمید مبتنی بر ذرات Promega استفاده می‌شود، می تواند در پروتکل‌های خودکار استفاده شود، اما می‌تواند با زیست توده غرق شود. هنگامی که یک لیز پاک شده تولید شد، DNA را می‌توان با روش‌های شیمیایی مختلف مانند سیلیس، تبادل یونی، سلولز یا روش‌های مبتنی بر رسوب خالص سازی کرد.
۳. اتصال به ماتریس تصفیه
صرف نظر از روشی که برای ایجاد یک لیز پاک شده استفاده می‌شود، DNA مورد نظر را می‌توان با استفاده از روش‌های مختلف جدا کرد. Promega سیستم‌های جداسازی DNA ژنومی را بر اساس لیز نمونه توسط مواد شوینده و خالص‌سازی با اتصال به ماتریس‌ها (سیلیکا، سلولز و تبادل یونی) ارائه می‌کند، که در سال‌های اخیر توجه عمده‌ای به آن جلب شده است.
هر یک از این ترکیبات شیمیایی می‌توانند بر کارایی و خلوص جداسازی تأثیر بگذارند و هر کدام دارای ظرفیت اتصال مشخصی هستند. ظرفیت اتصال نشان دهنده این است که یک شیمی جداسازی چه مقدار اسید نوکلئیک می‌تواند قبل از رسیدن به ظرفیت سیستم متصل کند و دیگر مقدار بیشتری از آن اسید نوکلئیک را جدا کند. ما می‌توانیم ویژگی‌های طراحی را در این شیمی‌ها با دستکاری شرایط اتصال برای غنی‌سازی دسته‌های مختلف اسید نوکلئیک بسازیم (به عنوان مثال، شیمی‌هایی که به طور انتخابی RNA را در مقابل DNA یا قطعات بزرگ در مقابل قطعات کوچک متصل می‌کنند).
۴. شستشو پروتئین ها و سایر آلاینده ها
بافرهای شستشو معمولا حاوی الکل هستند و می‌توانند برای حذف پروتئین‌ها، نمک‌ها و سایر آلاینده‌ها از نمونه یا بافرهای اتصال بالادست استفاده شوند. الکل‌ها علاوه بر این به پیوند اسید نوکلئیک با ماتریکس کمک می‌کنند.
۵. شستشو DNA
DNA در محلول های کم قدرت یونی مانند بافر TE یا آب بدون نوکلئاز محلول است. هنگامی که چنین بافر آبی به غشای سیلیکا اعمال می‌شود، DNA از سیلیس آزاد می‌شود و مایع خروجی جمع آوری می‌شود. پس از آن DNA خالص شده و با کیفیت بالا آماده استفاده در طیف گسترده‌ای از کاربردهای پایین دستی، مانند Multiplex PCR، سیستم‌های رونویسی/ترجمه در شرایط آزمایشگاهی، واکنش‌های ترانسفکشن و تعیین توالی است.
هنگام انتخاب بافر شستشو، مهم است که الزامات فرآیندهای پایین دستی مورد نظر خود را در نظر بگیرید. به عنوان مثال، شستشو و ذخیره DNA در بافر TE تا زمانی که EDTA بر برنامه‌های پایین دستی انتخابی شما تأثیری نداشته باشد، مفید است. EDTA منیزیم موجود در DNA خالص شده را کلات می‌کند یا به آن متصل می‌کند و می‌تواند به مهار فعالیت نوکلئازهای آلوده کننده احتمالی کمک کند. اگر EDTA نگران کننده است، توصیه می‌کنیم DNA را در محلول بافری ذخیره کنید، زیرا ماهیت اسیدی DNA می‌تواند منجر به اتو هیدرولیز شود. همچنین می‌توانید از بافر TE-4 استفاده کنید که ۱۰ میلی‌متر Tris-HCl، ۰.۱ میلی‌متر EDTA (pH 8.0) است.
استخراج DNA مایع-مایع
استخراج مایع-مایع یکی از رایج ترین روش‌ها برای استخراج اسید نوکلئیک است. در این روش از محلول‌های تهیه شده با ترکیبات شیمیایی مختلف برای استخراج استفاده می شود و عمدتاً متکی بر تهیه بافر لیز است.
بافر لیز در یک یا دو محلول تهیه می‌شود؛ زیرا از مواد شیمیایی زیادی استفاده می‌کند. مواد شیمیایی رایجی که برای استخراج DNA مایع-مایع استفاده می‌شوند عبارتند از: فنل، کلروفرم، ایزوآمیل الکل، CTAB، SDS، Tris، EDTA، MgCl2 و دیگر مواد شوینده.
استخراج DNA نمکی
روش استخراج یک روش ساده و غیر سمی است که DNA با کیفیت بالا را از خون کامل جدا می‌کند. در روش استاندارد نمک زدایی، پروتئین‌های K و RNase پس از لیز سلول‌ها به آن‌ها اضافه می‌شود. NaCl اشباع برای رسوب کردن پروتئین‌ها از محلول مورد نیاز بود. نمونه‌های سلولی سانتریفیوژ می شوند و سپس DNA با شستشوی آن با مواد شوینده مانند اتانول جدا می شود.
نتیجه گیری
آرین پژوه وظیفه آماده سازی، تهیه و خرید دستگاه آزمایشگاهی استخراج DNA را بر عهده دارد. با کمک دستگاه‌های موجود به راحتی می‌توانید از انواع روش‌های استخراج dna استفاده کنید و بهترین آزمایشات را با بهترین نتایج به دست آورید. هم به صورت آنلاین و هم به صورت حضوری می‌توانید انواع تجهیزات آزمایشگاهی را از وب سایت یا فروشگاه آرین پژوه تهیه کنید.
